本文隸屬于復雜制劑應(yīng)用專題，全文共 7076 字，閱讀大約需要 18 分鐘

摘要：疫苗中亞可見顆粒的存在對產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量一致性具有重要影響。這些顆?？赡軄碓从诘鞍踪|(zhì)聚集、乳化劑聚集或外源性微粒，盡管尺寸處于亞可見范圍，仍可能誘發(fā)免疫反應(yīng)或注射部位不良反應(yīng)。由于亞可見顆粒粒徑小、來源復雜、濃度低且易受配方干擾，傳統(tǒng)檢測手段難以實現(xiàn)準確量化。AccuSizer顆粒計數(shù)器憑借高靈敏度、寬動態(tài)范圍、高分辨率和快速測量的優(yōu)勢，能夠有效解決疫苗亞可見顆粒檢測中的關(guān)鍵難題，為疫苗研發(fā)、質(zhì)量控制及法規(guī)符合提供可靠工具。本文系統(tǒng)分析了亞可見顆粒的特性及其對疫苗質(zhì)量的影響，總結(jié)了檢測難點，并探討了AccuSizer在相關(guān)應(yīng)用中的優(yōu)勢與實踐案例。

關(guān)鍵詞：疫苗；顆粒檢測；AccuSizer；亞可見顆粒

疫苗是一類用于預防感染性疾病的生物制品，其通過激發(fā)機體特異性免疫應(yīng)答獲得免疫保護。按照制備原理的不同，常見的疫苗類型包括：

• 滅活疫苗：通過化學或物理方法滅活病原體，如滅活流感疫苗

• 減毒活疫苗：通過削弱病原體毒力制備，如麻疹疫苗

• 重組蛋白疫苗：利用重組技術(shù)表達特定抗原蛋白，如乙型肝炎疫苗

• 核酸疫苗：基于mRNA或DNA表達抗原蛋白，如部分疫苗

不同類型疫苗中蛋白質(zhì)含量、輔料成分和佐劑配比差異明顯，這直接影響顆粒形成和分布特性。

圖1：疫苗類型示意圖[1]

疫苗中的顆粒來源復雜，可依據(jù)不同劃分原則進行分類。按粒徑范圍，通常分為可見顆粒與亞可見顆粒；按來源，則可分為內(nèi)源性顆粒與外源性顆粒。

內(nèi)源性顆粒主要源于疫苗配方自身成分的理化變化。典型例子有蛋白質(zhì)聚集體和乳化劑顆粒。

1.2.1.1蛋白質(zhì)聚集體

蛋白質(zhì)類疫苗在生產(chǎn)、運輸及儲存過程中極易受到物理、化學因素的影響，如溫度波動、凍融循環(huán)以及pH變化等。這些應(yīng)激條件會導致蛋白質(zhì)分子部分折疊或發(fā)生不可逆聚集，進而形成不同尺寸范圍的亞可見顆粒（subvisible particles, SVPs）[2,3]。如圖2展示了蛋白質(zhì)在受到外界因素影響時，其結(jié)構(gòu)變化形成蛋白質(zhì)聚集體的過程。從初始的折疊、有序的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)開始，經(jīng)過一系列中間狀態(tài)，最終形成不同形式的聚集體。這一過程直觀地呈現(xiàn)了蛋白質(zhì)類疫苗在不利環(huán)境下可能發(fā)生的結(jié)構(gòu)改變，這些改變正是導致顆粒形成的原因。研究表明，這類顆粒不僅會降低疫苗制劑的長期穩(wěn)定性，還可能增強其免疫原性，誘導機體產(chǎn)生非預期的免疫反應(yīng)甚至免疫原性相關(guān)不良事件[4]。這些顆粒可能引起免疫原性增加或降低疫苗穩(wěn)定性，對其進行有效監(jiān)測和表征對于保證疫苗的安全性和療效至關(guān)重要。

圖2：蛋白質(zhì)不同聚集狀態(tài)的示意圖

1.2.1.2 乳化劑顆粒

油包水乳液型佐劑（如MF59、AS03）中的乳劑顆粒本身屬于功能性成分，通常處于亞微米級別，對疫苗的免疫增強效果具有重要作用。然而，在貯存或運輸過程中，乳劑顆?？赡馨l(fā)生聚集或粒徑異常增大，形成亞可見或不溶性大顆粒，進而影響制劑的物理穩(wěn)定性與用藥安全性。若顆粒過大，易導致乳劑分層、聚集，并增加注射部位的不良反應(yīng)風險；而顆粒尺寸若偏離預期范圍過小，則可能引起體內(nèi)快速清除或免疫應(yīng)答不足，均會削弱疫苗的有效性與安全性。

以諾華乳佐劑（WO2011067669A2）為例，其中明確指出需對粒徑在1.2 μm以上的顆粒進行監(jiān)控與定量分析，并制定了相應(yīng)的測量標準。采用AccuSizer系列顆粒計數(shù)器進行檢測，正是基于對大顆粒影響乳劑穩(wěn)定性的考量。此類大顆粒的存在可能加劇聚集與分層現(xiàn)象，從而影響佐劑免疫效果的一致性與安全性^[5]。該實例表明，AccuSizer在乳劑體系中對亞可見及不溶性大顆粒的高精度監(jiān)測具有明確的應(yīng)用價值。

圖3：諾華乳佐劑

疫苗中的外源性微粒來源復雜，可能在生產(chǎn)、包裝、運輸、儲存、開啟及臨床使用的各個環(huán)節(jié)被引入。這進一步強調(diào)了嚴格控制微粒污染的必要性，以及在藥品包裝設(shè)計、操作流程規(guī)范和終端臨床使用中采取系統(tǒng)性風險控制措施的重要性。

圖4：可能引入外源性微粒途徑示意圖

案例分享：安瓿瓶不同打開方式與藥品微粒含量實驗及其結(jié)果；該實驗設(shè)置了三種不同的安瓿瓶打開方式作為研究變量，分別Our Method、常General Method以及Open adaptor。實驗過程中，嚴格遵循標準操作流程，實驗結(jié)果通過柱狀圖清晰呈現(xiàn)。

圖5：安瓿瓶不同打開方式操作示意圖

圖6：安瓿瓶A、B、C三種打開方式藥品微粒含量對比

從圖示結(jié)果可以看出，安瓿瓶玻璃在受力斷裂時，無論是使用開瓶器還是直接用手掰開安瓿瓶，都會在開啟過程中產(chǎn)生數(shù)量不等的微粒。

這些外源顆粒的存在給疫苗注射安全埋下了隱患，可能致使接種部位出現(xiàn)刺激癥狀、引發(fā)炎癥等不良后果。^[6]

健康風險是疫苗安全性關(guān)注的核心。研究表明，疫苗用輔料（如蔗糖）中若存在不溶性微粒，可能激發(fā)異常的免疫應(yīng)答。例如，基于小鼠腘窩淋巴結(jié)模型的實驗顯示，蔗糖中的不溶性微粒可引發(fā)免疫反應(yīng)，提示在疫苗輔料的質(zhì)量控制中需重視不溶性微粒的合理管控。^[6]

正常情況下，疫苗注射后機體會產(chǎn)生預期的免疫應(yīng)答并伴隨一些輕微、正常的生理反應(yīng)，但也可能出現(xiàn)異常情況。圖7直觀對比疫苗注射后機體的正常反應(yīng)與異常反應(yīng)：左側(cè)顯示注射后局部組織無異常炎癥表現(xiàn)，僅產(chǎn)生預期免疫應(yīng)答和組織相關(guān)的輕微、正常生理反應(yīng)；右側(cè)顯示可能會產(chǎn)生的血管栓塞風險、組織反應(yīng)異常、過敏反應(yīng)等伴隨的異常病理反應(yīng)。

隨著微粒進入機體循環(huán)，還可能引起更大的全身健康風險，如圖8所示。^[7]

圖7:注射疫苗免疫反應(yīng)對比圖

圖8：微粒引起健康風險圖示

疫苗中含有多種成分，其中不少是以蛋白質(zhì)為基礎(chǔ)的物質(zhì)，抗原便是典型的蛋白質(zhì)成分。在疫苗的研發(fā)、生產(chǎn)和儲存過程中，由于各種因素（如溫度變化、pH 值波動、機械應(yīng)力等）的影響，抗原蛋白質(zhì)可能會發(fā)生聚集現(xiàn)象。蛋白質(zhì)聚集可能改變抗原構(gòu)象，降低疫苗誘導的特異性免疫應(yīng)答。乳化劑顆粒分布不均則可能導致佐劑作用不穩(wěn)定，影響免疫增強效果。^[8]

如圖9所示：左側(cè)展示了典型的Y形抗體分子結(jié)構(gòu)，正常情況下，其兩個臂端可與特定抗原實現(xiàn)特異性結(jié)合，這是啟動正常免疫應(yīng)答的關(guān)鍵步驟。然而，右側(cè)呈現(xiàn)了抗原發(fā)生蛋白聚集后的狀態(tài)，大量抗原聚集形成較大的聚集體。這種聚集改變了抗原的原有結(jié)構(gòu)和表位暴露情況，導致抗體無法與聚集后的抗原進行有效結(jié)合。一旦無法實現(xiàn)特異性結(jié)合，正常的免疫應(yīng)答過程便無法啟動，在疫苗應(yīng)用的情境下，也就意味著疫苗無法發(fā)揮預期的免疫效果，影響了其保護機體免受相應(yīng)病原體侵害的能力。因此，對亞可見顆粒進行精確監(jiān)控是保證疫苗免疫效果的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

圖9：抗原抗體正常特異性結(jié)合及蛋白聚集導致的異常結(jié)合示意圖

疫苗投入市場前，企業(yè)完成全部檢驗項目后，必須由國家藥品監(jiān)管部門對每批疫苗的質(zhì)量進行嚴格審核、檢驗。企業(yè)的質(zhì)量自檢旨在確保疫苗的安全、有效、合規(guī)，涵蓋從原料到成品的每個環(huán)節(jié)，通過嚴格的質(zhì)量控制，保障疫苗質(zhì)量符合國家標準。^[9]

我國自 2006 年開始對進口 MMR 制品實行批簽發(fā)全檢，2008 年開始對國產(chǎn) MMR 制品實行批簽發(fā)資料審核與實驗室項目部分檢定。中國無進口MMR 制品后,國產(chǎn) MMR 疫苗的批簽發(fā)數(shù)量明顯增加，見圖10。^[10]

圖 10：2006~2016 年間 MMR 疫苗批簽發(fā)人份數(shù)統(tǒng)計

疫苗產(chǎn)量的大規(guī)模提升對疫苗的質(zhì)量提出了嚴峻的考驗，維持疫苗的批間穩(wěn)定性與一致性是保證疫苗有效性與安全性的關(guān)鍵。

各國藥典對注射劑中的微粒均有嚴格要求，但檢測范圍和限值存在差異。以注射劑中不溶性微粒為例：美國藥典USP <788> 對注射劑≥10 μm和≥25 μm的顆粒設(shè)定了明確限值，見表格1。中國藥典（ChP）：對不溶性微粒的檢測范圍相對較窄，主要針對部分常規(guī)注射劑，對特定類型疫苗或含佐劑的復雜制劑尚未全涵蓋。雖藥典規(guī)定的“不溶性微粒"檢測僅覆蓋部分注射制劑，并非涵蓋所有類型的疫苗；但在疫苗研發(fā)與質(zhì)量控制實踐中，企業(yè)已普遍將微粒監(jiān)測納入關(guān)鍵檢測項目。這一趨勢正好反映了從“科學風險"到“法規(guī)要求"的轉(zhuǎn)化過程。^[11][12]

表格1：USP <788>關(guān)于注射劑規(guī)定

疫苗顆粒的物理化學特性會影響其穩(wěn)定性、免疫原性和安全性。然而，疫苗制劑中顆粒體系的復雜性以及檢測環(huán)境的敏感性使得精準表征疫苗顆粒面臨多重技術(shù)挑戰(zhàn)。以下從顆粒來源、濃度、配方干擾及樣品制備四個維度，分析疫苗顆粒檢測的難點。

疫苗制劑中顆粒來源多樣，可分為內(nèi)源性顆粒和外源性顆粒兩大類。不同來源的顆粒可能具有相似的粒徑或光學特性，但其潛在風險截然不同。這對檢測儀器的分辨率、檢測原理的針對性以及數(shù)據(jù)分析能力提出了要求。

在疫苗研發(fā)階段，可用于顆粒檢測的樣品通常非常有限，尤其是臨床前或早期研發(fā)樣品，無法進行大規(guī)模取樣。這就對檢測儀器提出了高要求：必須具備高靈敏度、低樣品消耗和精確量化能力，才能在微量樣品條件下準確監(jiān)測顆粒，避免漏檢或誤判。

高蛋白濃度、鹽類或乳化劑可能影響光學或阻抗檢測信號，導致假陽性或假陰性結(jié)果，給檢測帶來挑戰(zhàn)。

稀釋、攪拌或溫度變化可能導致顆粒聚集或解聚，影響測量結(jié)果的準確性。因此，減少樣品制備干擾是確保檢測可靠性的關(guān)鍵。

疫苗顆粒檢測面臨多重挑戰(zhàn)，包括顆粒微小、濃度低、來源復雜、配方干擾以及法規(guī)要求嚴格。AccuSizer顆粒計數(shù)器在應(yīng)對這些難點時具有多方面優(yōu)勢，可以分為以下幾點：

疫苗樣品在研發(fā)、生產(chǎn)及質(zhì)量控制過程中，有時可獲取的樣品體積較小。AccuSizer靈敏度高達10PPT級別，即使只有微量的顆粒通過傳感器，也可以精準檢測出來。確保即使在樣品量有限的情況下，也能全面評估疫苗的安全性和穩(wěn)定性，避免因漏檢微量顆粒而影響疫苗質(zhì)量

圖11：微量進樣不同體積精確性對比表

新版藥典USP<787>對于體積精度提出了苛刻的要求。AccuSizer 系列儀器對進樣體積、流速及計數(shù)準確性分辨率經(jīng)過嚴格驗證，最小的進樣量可達50μL(依不同配置)。

從表中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn),從650μL至50μL所檢測的不同體積中,所得到的每毫升的顆粒數(shù)基本相同,其RSD值在50uL處依舊維持在2.4%,可見AccuSizer系列儀器在微量進樣的技術(shù)層面,依然可以提供精確的數(shù)據(jù)。

AccuSizer系列顆粒計數(shù)器專為高濃度樣本的檢測提供解決方案。其獨特的設(shè)計理念特別適合高濃度樣本，搭配自動稀釋模塊更是可以檢測濃度高達10¹²#/mL的樣本。這使其適用于顆粒濃度變化較大的疫苗樣品，包括部分乳佐劑制劑。

圖 12:自動稀釋系統(tǒng)原理圖  圖13:二步稀釋系統(tǒng)原理圖

如圖14所示AccuSizer系列顆粒計數(shù)器（分別應(yīng)對LE、FX、Fxnano傳感器）測試數(shù)據(jù)結(jié)果，A7000 APS結(jié)果圖(LE傳感器)濃度高達: 3.72E+007 顆/mL。

圖14：AccuSizer系列（分別應(yīng)對LE、FX、Fxnano傳感器）測試數(shù)據(jù)結(jié)果

在高蛋白、高鹽或乳化劑復雜體系中，AccuSizer通過單顆粒光學傳感計數(shù)(Single Particle Optical Sizing,SPOS)，可實現(xiàn)對分散體系中的不溶物微粒量化計數(shù),減少配方干擾導致的假信號。這對于保證結(jié)果準確性和重復性至關(guān)重要。

圖15：SPOS原理圖

AccuSizer測量結(jié)果重復性高，可追溯性強，符合國內(nèi)外藥典（如USP<788>及中國藥典2025版）對亞可見顆粒檢測的要求，可用于批次間對比和質(zhì)量控制，為疫苗研發(fā)和生產(chǎn)提供可靠的數(shù)據(jù)支持。

圖16：CP0903 檢測報告

圖17：USP788 檢測報告

AccuSizer系列顆粒計數(shù)器通過搭配不同傳感器、進樣器，適配不同的樣本的測試需求，能快速而準確地測量顆粒粒徑以及顆粒數(shù)量/濃度的伙伴。

疫苗中的亞可見顆粒是影響其安全性與有效性的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。無論是蛋白質(zhì)抗原的聚集體、乳佐劑的粒度分布，還是包材引入的外源性微粒，均需進行精準監(jiān)控。AccuSizer系列顆粒計數(shù)器憑借其寬檢測范圍、高靈敏度及符合國際標準的檢測方法，能夠在疫苗研發(fā)、生產(chǎn)、質(zhì)控和穩(wěn)定性研究的各個階段發(fā)揮作用。未來，隨著疫苗平臺的不斷更新和監(jiān)管要求的日益嚴格，AccuSizer將在疫苗行業(yè)中繼續(xù)發(fā)揮重要作用，為提升公共衛(wèi)生安全提供技術(shù)保障。